干貨分享—常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法匯總(一)

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常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法匯總(一)

讓我們一起學(xué)習(xí)一下吧~

細(xì)胞凋亡是一個(gè)進(jìn)程，該期間凋亡相關(guān)通路被激活，各種分子參與調(diào)控，出現(xiàn)一系列的凋亡特征。例如細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外；又例如當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)相較正常細(xì)胞而言會(huì)固縮。因此，通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)可鑒定凋亡水平。

本文分享了常見(jiàn)的幾種細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，讓我們一起學(xué)習(xí)一下吧~

形態(tài)學(xué)檢測(cè)

發(fā)生凋亡的細(xì)胞在形態(tài)上有一定的特征：相較正常細(xì)胞而言，凋亡細(xì)胞體積變小，凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；凋亡晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。在透射電子顯微鏡下可看到凋亡細(xì)胞體積變小，表面微絨毛消失，細(xì)胞質(zhì)濃縮。使用核染料（Hoechst系列、DAPI）染色后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下可看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染或細(xì)胞核裂解成碎塊狀呈致密濃染。

膜通透性改變

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜通透性會(huì)逐漸降低。Hoechst系列可以穿透細(xì)胞膜，染色后凋亡細(xì)胞熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。膜不可滲透性染料（例如：Propidium Iodide/PI）不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞不能染色。而對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，膜不可滲透性染料染料可以染色壞死細(xì)胞。根據(jù)此特性，使用Hoechst系列和PI染料雙染后，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)，正常細(xì)胞為弱紅色熒光＋弱藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光＋強(qiáng)藍(lán)色熒光，壞死細(xì)胞為強(qiáng)紅色熒光＋強(qiáng)藍(lán)色熒光。

磷脂酰絲氨酸（PS）

翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。

Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。7-AAD是一種非滲透性的核酸熒光染料，該染料不能透過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜，但可穿透膜損傷細(xì)胞如晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合，可用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。因此，可以采用AnnexinV與7-AAD雙染的方法，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。